Protidogramma Approfondito

PROTIDOGRAMMA

Il plasma contiene molecole proteiche che differiscono tra di loro per:

• dimensioni molecolari, alcune proteine sono piccole come l'insulina e altre di dimensioni notevoli e una complessa struttura quaternaria come le lipoproteine;
• diversa composizione chimica, alcune proteine semplici come albumina altre coniugate come lipoproteine e glicoproteine;
• diversa resistenza al calore o ad altri agenti denaturanti;
• diversa funzione ad es. proteine di trasporto di sostanze lipofiliche, enzimi, inibitori di enzimi, ormoni, fattori della coagulazione, inibitori della coagulazione e anticorpi.

Le indagini di laboratorio sulle proteine plasmatiche offrono utili informazioni diagnostiche. Sfruttando le diverse proprietà funzionali e fisico-chimiche, le proteine sono suddivisibili in frazioni in numero tanto maggiore quanto più fine e sensibile è la tecnica di analisi.

L’elettroforesi sieroproteica o delle proteine del siero è la metodica di laboratorio con la quale si effettua il PROTIDOGRAMMA; con tale metodica si separano le proteine in base alla loro carica elettrica e a loro P.M.

• L'elettroforesi

Con il termine elettroforesi si indica comunemente il movimento di particelle elettricamente cariche in presenza di un campo elettrico. In base ai principi base dell'elettroforesi, queste molecole, che posseggono gruppi ionizzabili, una volta caricate in un gel elettroforetico o depositate sulla superficie di un supporto (come l’acetato di cellulosa), vengono sottoposte a una forza elettrica proporzionale alla loro carica effettiva, Q e all'intensità del campo elettrico, E. Il pH della soluzione tampone presente nella cella elettroforetica determina la carica delle molecole che si separano secondo il loro rapporto massa/carica e l’attrito che incontrano nel muoversi. L'apparato elettroforetico è costituito da un generatore e da una cella elettroforetica. Il generatore fornisce un flusso di corrente continua agli elettrodi che sono collegati alla cella, generando quindi un campo elettrico in cui i cationi migreranno verso il catodo e gli anioni verso l'anodo.

L'analisi elettroforetica delle proteine sieriche (nota come "quadro proteico") è un'analisi di routine che consente di evidenziare alterazioni grossolane della composizione proteica del siero. Il campione viene deposto sulla superficie del supporto di acetato di cellulosa che è imbibito del tampone di corsa e successivamente viene applicata la forza elettrica. Le proteine sono evidenziate mediante una colorazione specifica, e la loro composizione percentuale è misurata mediante densitometria. In condizioni fisiologiche, le proteine sieriche si suddividono in 5 frazioni; nota la proteinemia (rappresenta il 100%) è possibile ricavare la concentrazione di ciascuna frazione: albumina, 1-globuline, 2-globuline, -globuline, -globuline. In condizioni fisiologiche, la frazione di albumina e la somma delle frazioni di globuline sono in un rapporto di 1,2 – 1,7 (rapporto A/G). Alterazioni notevoli da questo intervallo sono segnale di patologia.

Le 5 frazioni sono:

1. La frazione albumina, questa frazione contiene solo 2 proteine, l'albumina e la pre-albumina, prodotte dal fegato, con la funzione di veicolare sostanze insolubili (farmaci, bilirubina) e di mantenere la pressione colloidosmotica del sangue, impedendo all'acqua di uscire dai vasi sanguigni negli interstizi. L'analisi di questa frazione può essere definita normale se la sua percen tuale è compresa tra il 59.1 e 69.3, rispetto alla proteinemia, e la sua quantità si trova compresa tra i 3,5 - 5 gr/dl di sangue.
   • Se la percentuale o la quantità aumentano rispetto ai valori nor mali, significa che le altre proteine si sono ridotte. È un dato, comunque, che non ha una grande rilevanza clinica per il medico.
   • Se la percentuale diminuisce, ma non la quantità, significa che le altre proteine, per differenza, sono aumentate. Questo dato potrebbe orientare il medico verso alcuni approfondimenti relativamente a malattie infiammatorie o il mieloma.
   • Se diminuiscono sia la percentuale sia la quantità, significa che il fegato non svolge in modo corretto la sua funzione. Questa alterazione, in genere, indica una cirrosi epatica.

Inoltre, in caso di ipoalbuminemia, l'acqua si accumula nei tessuti, principalmente nei polmoni (edema polmonare) e questa frazione diminuisce nel corso dell'epatite virale, nelle sindromi nefrosiche, durante la fase acuta dei processi infiammatori.

2. La frazione 1-globuline, questa frazione comprende la glicoproteina acida, l'antitripsina e l'antichimotripsina.

La glicoproteina acida entra nel gruppo delle "proteine della fase acuta", un gruppo eterogeneo di proteine che aumentano nel plasma durante un processo infiammatorio, dopo un trauma, nella necrosi, nella fase acuta di una lesione tissutale.

L'antitripsina è una proteina con attività di inibitore delle proteasi. Inibisce l’elastasi che viene rilasciata dai neutrofili per combattere l’infezione. Carenza di questa proteina può distruggere gli alveoli (enfisema).

L'antichimotripsina ha il ruolo fisiologico di inibire la chimotripsina pancreatica.

L'analisi di questa frazione può essere definita normale se la sua percen tuale si trova nell'intervallo compreso tra 2 e 3.5 e la sua quantità si trova compresa tra 0,1-0,4 gr/dl di sangue.

• La diminuzione della percentuale o della quantità può indicare disfunzioni epatiche o carenze congenite.
• Se la percentuale o la quantità aumentano rispetto ai valori nor mali, l'alterazione indica un processo infiammatorio o una infezione in corso all'interno dell'organismo.

3. La frazione 2-globuline, contiene l'aptoglobina, la macroglobulina e l'antitrombina III.

L'aptoglobina esiste in più forme molecolari geneticamente determinate. Il suo ruolo fisiologico consiste nella capacità di legare immediatamente l'emoglobina che si libera dalla quota di emazie fisiologicamente distrutte per veicolarla dove avviene la definitiva decomposizione; la formazione del complesso aptoglobina-emoglobina impedisce il passaggio di emoglobina nelle urine. L'aptoglobina aumenta nel siero in corso di processi infiammatori. Una diminuzione di aptoglobina si correla con gravi epatopatie e con emolisi intravascolare.

La macroglobulina è una delle più grosse proteine plasmatiche e svolge importanti compiti fisiologici tra cui inibizione non specifica nei confronti di enzimi proteolitici e trasporto di alcuni ormoni polipeptidici. Un aumento nettissimo di tale proteina si verifica nel corso delle sindromi nefrosiche, nel diabete mellito, nelle epatopatie croniche. Valori diminuiti si hanno nell'artrite reumatoide.

L'antitrombina III ha il compito di neutralizzare la trombina che nel processo di emocoagulazione si forma sempre in eccesso e potrebbe attivare pericolosamente una quantità esorbitante di fibrinogeno. Essa diminuisce sia per difetto di sintesi da parte del fegato sia per un suo troppo rapido consumo. Una prova di carattere funzionale consiste nella misura del ritardo provocato dalla proteina sul tempo di coagulazione del fibrinogeno bovino ad opera di una certa quantità di trombina (tempo di antitrombina III).

L'analisi di questa frazione può essere definita normale se la sua percen tuale si trova nell'intervallo compreso tra 6.1 e 11.2 e la sua quantità si trova compresa tra 0,4-1,0 gr/dl di sangue.

• La diminuzione della percentuale o della quantità non ha alcun significato clinico.
• Se la percentuale o la quantità aumentano rispetto ai valori nor mali, l'alterazione indica un processo infiammatorio o una infezione in corso all'interno dell'organismo.

4. La frazione -globuline, a cui appartengono la transferrina e la proteina C reattiva e il fibrinogeno.

La transferrina ha il compito di trasportare il ferro (in forma ferrica) dal tubo digerente ai depositi tissutali e da questi al midollo osseo dove è utilizzato dagli eritroblasti per la sintesi dell'emoglobina. Ogni molecola di transferrina lega due atomi di ferro; in condizioni normali, un terzo della transferrina presente nel sangue è legata al ferro, i restanti due terzi sono liberi.

La proteina C reattiva è una proteina della fase acuta. La sua determinazione, assai utile nel corso della malattia reumatica di cui costituisce l'indice probabilmente più sensibile, può essere eseguita con metodi immunologici.
L'analisi di questa frazione può essere definita normale se la sua percen tuale si trova nell'intervallo compreso tra 6.30 e 12.1 e la sua quantità si trova compresa tra 0,6-1,0 gr/dl di sangue.

• La diminuzione della percentuale o della quantità non ha alcun significato clinico.
• Se la percentuale o la quantità aumentano rispetto ai valori nor mali, l'alterazione può essere un segnale di anemia perché tra le beta-globuline è presente la transferrina, che aumenta quando il ferro nel l'organismo è basso, o nelle epatopatie tossiche e infettive.

Il fibrinogeno non è presente nel profilo elettroforetico poiché quest'ultimo si riferisce alle proteine del siero, che è appunto plasma privato del fibrinogeno. Il fibrinogeno riveste importanza fondamentale nel processo della coagulazione. La quantità di fibrinogeno nel plasma subisce variazioni per diverse cause morbose. Si tratta di una proteina della fase acuta. Più importanti degli aumenti sono le diminuzioni del fibrinogeno in corso di malattie acquisite (epatopatie) o congenite. Una grave, ma rara, malattia ereditaria è caratterizzata dalla incapacità di sintetizzare il fibrinogeno, con una grande tendenza ad emorragie spontanee. In altri casi ereditari il fibrinogeno è presente in quantità ridotta, o sono presenti forme anomale con una funzionalità alterata. Livelli diminuiti di fibrinogeno si hanno in tutte le situazioni emorragiche caratterizzate da bassi valori di quasi tutti i fattori della coagulazione.

5. La frazione delle y-globuline, o immunoglobuline (Ig), si divide in 5 classi che differiscono per la diversa composizione delle catene pesanti (    ), per la struttura globale ed il peso molecolare. Le catene leggere ( o ) rappresentano elementi comuni a tutte le classi di Ig.

L'analisi di questa frazione può essere definita normale se la sua percen tuale si trova nell'intervallo compreso tra 9.8 e 20 e la sua quantità si trova compresa tra 0.8 e 1.7 grammi per decilitro di sangue.

• La diminuzione della percentuale o della quantità indica una ridotta produzione di anticorpi, può indicare immunodeficienze acquisite o congenite.
• Se la percentuale o la quantità aumentano rispetto ai valori nor mali, l'alterazione è un segnale di:
  • malattia policlonale, quando l'aumento comprende tutti i tipi di anticor pi ed è tipico delle infiammazioni acute o croniche, per cui indica un proces so infiammatorio o una infezione in corso o malattie autoimmuni;

• malattia monoclonale, se l’aumento è dovuto alla produzione anormale di un solo tipo di anticorpo. Un’alterazione monoclonale elevata, può indicare la presenza di "plasmacitoma" o "mieloma multiplo", tumore mali gno, oppure di una "gammapatia monoclonale benigna", una malattia piuttosto diffusa nella popolazione che, in alcuni casi, è associata a malattie infettive o croniche e può scomparire naturalmente.

Il protidogramma è utile per valutare la corretta funzionalità del fegato, la presenza di infiammazioni o infezioni nell'organismo e può orientare il medico verso la diagnosi di malattie più gravi che richiedono ulteriori approfondimenti come il "mieloma multiplo". Per effettuare l'elettroforesi delle proteine del siero è sufficiente un sem plice prelievo di sangue che deve essere eseguito a digiuno da dodici ore, in modo che il cibo non interferisca con il risultato. L'assunzione di farmaci non influenza l'esito dell'analisi, ma è consigliabile, in ogni caso, segnalare al medico eventuali terapie farmacologiche in corso, importanti per valutare lo stato di salute globale della persona.

Quello che otteniamo col protidogramma è una “fotografia” delle proteine contenute nel sangue raggruppate per “frazioni”. Un buon osservatore potrà quindi, già dal grafico, individuare anomalie nella composizione proteica, senza dover necessariamente avere a disposizione i singoli dosaggi proteici. Il grafico con le curve è la proiezione fatta dal computer delle concentrazioni rilevate. Le frazioni vengono definite singolarmente in percentuale sulle proteine totali.

LE FRAZIONI DEL PROTIDOGRAMMA

Abbiamo 5 frazioni, ciascuna individuata da una “gobba” sul protidogramma.

(Protidogramma normale – archivio dell’autore)

Le diverse frazioni comprendono molte proteine.

Il protidogramma normale rispecchia i valori sopra citati per cui è facile fare confronti con protidogrammi patologici.

La forma patologica più facilmente riconoscibile nel protidogramma riguarda la gammopatia (l’aumento delle immunoglobuline contenute nella frazione gamma). Questa può essere monoclonale se sostenuta da un solo tipo di immunoglobuline (un picco stretto ed alto) o policlonale se sostenuto da più tipi di immunoglobuline (un picco ampio).

(Protidogramma da paziente con gammopatia monoclonale)

L’elettroforesi delle proteine è un tipo di analisi multiparametrica, ossia che rivela più di un valore per cui l’interpretazione finale dei dati deve essere sempre valutata da uno specialista del settore in quanto molto complessa.

NELLE EPATOPATIE CRONICHE GRAVI SI HA: ELEVATO INCREMENTO DELLE GAMMA CON EVENTUALE FUSIONE BETA-GAMMA. CIO’ È DOVUTO AD ATTIVAZIONE MESENCHIMALE E PROLIFERAZIONE LINFOIDE.

NEFROSI LIPOIDEA: In genere c’è ipoproteinemia marcata per riduzione molto marcata di albumina ed aumento delle alfa 2 e beta globuline. È dovuta ad un aumento di permeabilità del glomerulo con perdita di albumina, transferrina IgG, IgA (non IgM). Può essere compensata da un maggiore riassorbimento tubulare.

Altre tecniche per separare le proteine plasmatiche sono:

• Centrifugazione

Si basa sul comportamento delle particelle in un campo centrifugo. Le particelle sedimentano con velocità diverse a seconda delle caratteristiche di densità, dimensione e forma. Questa tecnica è utilizzata ad esempio per il frazionamento delle lipoproteine.

• SDS-PAGE

Un’elettroforesi in condizioni denaturanti su gel di poliacrilammide, che perette di valutare la massa molecolare di una proteina. Inoltre, può essere utilizzata per identificare una determinata proteina mediante il trasferimento su una membrana immobilizzante e il successivo riconoscimento con anticorpi specifici (western-blot).

• Cromatografia.

La tecnica cromatografica consiste nello sfruttare, in modo particolarmente efficiente, la diversa attitudine che ogni molecola o ione possiede nel distribuirsi fra due differenti fasi. La cromatografia è una tecnica di separazione delle componenti di una miscela omogenea basata sulla distribuzione dei suoi componenti tra due fasi, una stazionaria e una in movimento lungo una direzione definita. Indipendentemente dal meccanismo effettivo della separazione, legato al tipo di interazione fra soluto e fase stazionaria, durante la cromatografia ciascuna specie chimica si trova coinvolta in un processo dinamico nel quale essa si trasferisce dalla fase mobile a quella stazionaria, e viceversa. Nelle tecniche cromatografiche oggi in uso la fase stazionaria può essere un solido o un liquido, depositati su una superficie o introdotti in una colonna. Quanto alla fase mobile, può essere un gas o un liquido a bassa viscosità che viene fatto correre attraverso una colonna, oppure salire o scendere per capillarità lungo uno strato di fase stazionaria. I meccanismi di separazione nella cromatografia sono notoriamente tanti e di diversa specie con le relative variazioni per analisi più specifiche.